Lonza Amaxa 4D-Nucleofector細胞核轉染系統
——哺乳動(dòng)物真核細胞高效基因轉染



 

德國進(jìn)口Lonza 4D-Nucleofector細胞核轉染系統（原Amaxa 4D-Nucleofector核轉儀），創(chuàng )新性地結合經(jīng)典電穿孔技術(shù)和細胞特異性電轉染液，實(shí)現了DNA、RNA(如crRNA、tracrRNA、gRNA、sgRNA)、RNP核糖核蛋白復合體、蛋白質(zhì)（如Cas9核酸酶、切口酶、dCas9蛋白、Cas12a/Cpf1核酸酶）、小分子物質(zhì)高效轉染各類(lèi)哺乳動(dòng)物貼壁細胞、懸浮細胞、外泌體exosome等。

新款Lonza 4D核轉儀由用于小規模轉染的X模塊（4D-Nucleofector X Unit）、貼壁細胞不經(jīng)消化進(jìn)行原位轉染的Y模塊（4D-Nucleofector Y Unit）、單一細胞大規模流式轉染的LV模塊（4D-Nucleofector LV Unit）、高通量篩選的96孔模塊（原96-well Shuttle Device）組成。 點(diǎn)擊查看：Lonza Nucleofector 2B Device 單孔核轉儀2B型號

Lonza 4D-Nucleofector技術(shù)不依賴(lài)于細胞有絲分|裂，不受細胞增殖的影響，可直接將外源基因導入細胞核中，即使是未分|裂的原代細胞（如靜止的T淋巴細胞或神經(jīng)元），也可以快速表達。

Lonza 4D-Nucleofector對質(zhì)粒DNA轉染效率高達90％，寡核苷酸（如siRNA）轉染效率高達99％，面世20年來(lái)，已成功轉染＞1200種細胞系、＞130種原代細胞，并在干細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞等各類(lèi)較難轉染的細胞、以及外泌體電穿孔裝載藥物中獲得了優(yōu)秀的效果。

由于同種細胞系或原代細胞使用相同的轉染條件（轉染程序和轉染試劑盒），Lonza 4D-Nucleofector可實(shí)現多種外源物質(zhì)共轉染，例如CRISPR-Cas9基因編輯時(shí)共轉染2種sgRNA等。



圖. GFP標記的質(zhì)粒轉染新生兒皮膚成纖維細胞，2小時(shí)后用3.5% PFA 固定，共聚焦顯微鏡可觀(guān)察到GFP蛋白在細胞核內表達。

4D-Nucleofector細胞核轉染方法特點(diǎn)

1.針對每種細胞優(yōu)化的電脈沖參數，可將底物導入細胞質(zhì)甚至是細胞核；
2.特殊配方的電轉染液，同時(shí)提供高轉染效率和細胞保護，提高細胞轉染后存活率；
3.全球共享數據庫，專(zhuān)業(yè)指導，從細胞來(lái)源、傳代、培養條件、培養基、轉染程序選擇和操作技巧、到轉染后培養技巧，已形成成熟的實(shí)驗方案。



 

4D-Nucleofector核轉染系統為基因治療研究、免疫治療研究、干細胞研究等提供了方便的工具。相比電穿孔在內的其他非病毒轉染技術(shù)，更具優(yōu)勢：

-采用高分子聚合物電極，避免傳統鋁電極的離子毒害，維持細胞生理狀態(tài)，提高存活率。
-轉染后可快速觀(guān)察實(shí)驗結果，例如轉染GFP后最快2小時(shí)可觀(guān)察到蛋白。
-無(wú)需自己優(yōu)化條件，擁有超過(guò)759種細胞類(lèi)型的現成程序，可直接使用，全球共享數據庫，超過(guò)1500條轉染數據可供參考，并持續更新。
-可轉染包括DNA、mRNA、miRNA、siRNA、RNP、肽、蛋白質(zhì)、小分子化合物在內的多種底物。
-可用于難以轉染的原代細胞、干細胞、神經(jīng)元、細胞系，以及外泌體
-可不用消化細胞，進(jìn)行貼壁細胞的原位轉染。
-靈活的轉染規�？s放，可在低、中、高通量中輕松轉移，實(shí)現2×10^4至1×10^9個(gè)細胞數量的輕松擴展。
-全球發(fā)表文章超過(guò)14,000篇。

最近，Lonza 4D-Nucleofector核轉染系統已廣泛應用于通過(guò)RNAi、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a進(jìn)行的基因敲除研究、以及iPS誘導多能干細胞、CAR-NK、CAR-T、外泌體藥物遞送的研究中，在包括功能和結構基因組學(xué)、藥物發(fā)現以及基因和細胞療法的研究中大放異彩。

4D核轉儀結構和功能應用：

4D-Nucleofector細胞核轉染系統采用模塊化設計，可根據研究者的需求，自行組合數個(gè)模塊形成一套完整系統。

1、C模塊：4D-Nucleofector系統的控制單元，內置轉染程序，將不同的功能單元（模塊）整合為一個(gè)系統，以運行不同的應用程序。



 

2、X模塊：用于懸浮細胞、或貼壁細胞消化后的小規模轉染，轉染細胞數量2×10^4至2×10^7�？赏瑫r(shí)轉染2個(gè)100μL電轉杯、1個(gè)16孔電轉板條（每孔20μL），每個(gè)電轉杯、每個(gè)孔可獨立設置程序。另外在使用96孔模塊時(shí)，也需要X模塊。



 

3、Y模塊：用于貼壁細胞不經(jīng)消化的原位轉染，可同時(shí)轉染1個(gè)24孔電轉板條（每孔350μL），每個(gè)孔可獨立設置程序。



 

4、LV模塊：用于同一種懸浮細胞、或同一種貼壁細胞消化后的大規模轉染，轉染細胞數量1×10^7至2×10^9�？墒褂�1mL手動(dòng)進(jìn)樣電轉盤(pán)、或20mL連續進(jìn)樣電轉盤(pán)。通常使用X模塊小試摸條件，再用LV模塊線(xiàn)性放大轉染規模。



 

5、96孔模塊：用于同時(shí)轉染96個(gè)樣品的細胞，轉染細胞數量2×10^4至1×10^6。每個(gè)孔可獨立設置程序。必須與X模塊結合使用。


 

注：常用模塊組合參考
常規小規模轉染：C+X
貼壁細胞原位轉染：C+Y
懸浮+貼壁細胞轉染：C+X+Y
大規模轉染：C+X+LV
摸索復雜轉染條件：C+X+96孔

 

Lonza 4D-Nucleofector細胞核轉染系統參數
 

 

引用文獻：
1.Synchronous Disintegration of Ferroptosis Defense Axis via Engineered Exosome-Conjugated Magnetic Nanoparticles for Glioblastoma Therapy. Boyan Li, et al. Advanced Science, May 4, 2022
2.Mouse brain-wide transgene expression by systemic injection of genetically engineered exosomes: CAP-Exosomes. Saumyendra N Sarkar, Debora Corbin, James W Simpkins. bioRxiv, April 9, 2022
3.Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.Strecker J, et al. Nature (2019) 10(1): 212 
4.Gene correction for SCID-X1 in long-term hematopoietic stem cells.Pavel-Dinu M, et al. Nat Commun. (2019) 10 (1): 1634
5.Orthotopic replacement of T-cell receptor a- and ?-chains with preservation of near-physiological T-cell function.Schober K, et al. Nat Biomed Eng (2019) 10: 01 
6.Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.Oh SA, et al. Curr Protoc Immunol (2019) 124(1): e69 
7.Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.Nguyen DN, et al. Nat Biotechnol (2019) 1: 1 
8.CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Hultquist JF, et al. Nat Protocols (2019) 14(1): 1-27 
9.Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.Chen Cheng, et al. J Med Genetics (2019) 56: 10–17 
10.Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function. Shifrut E, et al. Cell (2018) 175(7): 1985-1971 
11.Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells. Ting PY, et al. Nat Methods (2018) 15(11)
12.Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.Castiglia S,et al.J Transl Med (2018) 16: 237 
13.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Vakulskas CA,et al.Nat Med (2018) 24(8): 1216-1224
14.Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.Roth TL,et al.Nature (2018) 559: 405-9
15.Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.Hu B,et al.Hum Gene Ther (2018)
16.Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Seki A,et al.J Exp Med (2018) 215(3): 985-997
17.Improved Expansion and In Vivo Function of Patient T Cells by a Serum-free Medium.Medvec AR,et al.Mol Ther Methods Clin Dev. (2017) 7; 8: 65-74
18.Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side.Hudecek M1,et al.Clin Exp Immunol (2017) 52(4): 355(80) 
19.CRISPR-Mediated Integration of Large Gene Cassettes Using AAV Donor Vectors.Bak RO,et al.Cell Rep (2017) 20(3): 750-756 
20.CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells.Zhang Y,et al.Frontiers in Immunology (2017) 1: 1-9 
21.CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.Rupp LJ1,et al.Scientific Reports (2017) 7 (1): 737 
22.A genome-wide CRISPR screen identifies a restricted set of HIV host dependency factors.Park RJ, et al.Nat Genet (2017) 49(2): 193-203 

4D-Nucleofector細胞核轉系統轉染RNP引用文獻
1. Seki A, Rutz S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 2018 Mar 5;215(3):985-997. doi: 10.1084/jem.20171626. Epub 2018 Feb 7. PMID: 29436394; PMCID: PMC5839763.
2. Oh SA, Seki A, Rutz S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Curr Protoc Immunol. 2019 Feb;124(1):e69. doi: 10.1002/cpim.69. Epub 2018 Oct 18. PMID: 30334617.
3. Naeimi Kararoudi M, Dolatshad H, Trikha P, Hussain SA, Elmas E, Foltz JA, Moseman JE, Thakkar A, Nakkula RJ, Lamb M, Chakravarti N, McLaughlin KJ, Lee DA. Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins. J Vis Exp. 2018 Jun 14;(136):58237. doi: 10.3791/58237. PMID: 29985369; PMCID: PMC6101749.
4. Farboud B, Jarvis E, Roth TL, Shin J, Corn JE, Marson A, Meyer BJ, Patel NH, Hochstrasser ML. Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J Vis Exp. 2018 May 25;(135):57350. doi: 10.3791/57350. PMID: 29889198; PMCID: PMC6101420.
5. Dewari PS, Southgate B, Mccarten K, Monogarov G, O'Duibhir E, Quinn N, Tyrer A, Leitner MC, Plumb C, Kalantzaki M, Blin C, Finch R, Bressan RB, Morrison G, Jacobi AM, Behlke MA, von Kriegsheim A, Tomlinson S, Krijgsveld J, Pollard SM. An efficient and scalable pipeline for epitope tagging in mammalian stem cells using Cas9 ribonucleoprotein. Elife. 2018 Apr 11;7:e35069. doi: 10.7554/eLife.35069. PMID: 29638216; PMCID: PMC5947990.
6. Daniel P. Dever1, Rasmus O. Bak1, Andreas Reinisch2, Joab Camarena1, Gabriel Washington1, Carmencita E. Nicolas1,
Mara Pavel-Dinu1, Nivi Saxena1, Alec B. Wilkens1, Sruthi Mantri1, Nobuko Uchida3, Ayal Hendel1, Anupama Narla4,
Ravindra Majeti2, Kenneth I. Weinberg1 & Matthew H. Porteus1. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.2016 Springer Nature doi:10.1038 (使用4D-Nucleofector LV大規模流式核轉染系統轉染RNP)

 

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